Opus Dei´s medarbejdere er mennesker som, uden at være medlemmer af prælaturet, hjælper til med forskellige opgaver såsom undervisning, sygepasning, samt kulturelle og sociale projekter osv. sammen med Opus Dei´s medlemmer.
Medarbejderne kan samarbejde indenfor disse aktiviteter hovedsageligt ved bøn, men også med arbejde eller med økonomisk støtte.
De får del i de åndelige gaver, som Kirken giver dem, der samarbejder med Opus Dei: aflad, som medarbejderne kan opnå på særlige dage om året, hvis de observerer de betingelser, Kirken har foreskrevet, og hver gang de af fromhed fornyer deres pligter som medarbejdere.
Fra Opus Dei prælaturet modtager de desuden den åndelige hjælp, som består i, at alle medlemmerne går i forbøn for dem, samt muligheden for at deltage i retræter, cirkler eller andre uddannelsesformer, om de skulle ønske det.
For at blive medarbejder behøver man ikke et særligt kald. Almindeligvis er det slægtninge, venner, arbejdskammerater eller naboer til Opus Dei medlemmer, som bliver medarbejdere, eller det er personer, som har agtelse for Sankt Josemaría og deltager i prælaturets apostoliske arbejde, eller de interesserer sig for de menneskelige og sociale opgaver, som fremmes og realiseres gennem Opus Dei´s apostoliske initiativ, og som medlemmerne driver.
Prælaturet´s vikar i hvert land udnævner en person til medarbejder på foranledning af et medlem fra Opus Dei.
Blandt Opus Dei´s medarbejdere findes katolikker, protestanter og troende fra andre religioner. Selv kvinder og mænd, der ikke er troende, eller som ikke bekender sig til noget trossamfund, kan være medarbejdere. De slutter sig til i ønsket om at deltage og samarbejde i de adskillige initiativer, som fremmes til gavn for samfundet og som er åbne for alle.
De medarbejdere, som ønsker det, kan deltage i de uddannelsesmidler, som prælaturet Opus Dei tilbyder. Denne uddannelse ansporer dem i deres åndelige liv til gennem gode gerninger at støtte Paven og biskopperne, samt personligt (uden at danne en gruppe) at give vidnesbyrd om deres kristne kald.
Mange personer finder gennem disse uddannelsesmidler muligheden for at udøve og udbrede et af de fundamentale kendetegn ved Opus Dei´s spiritualitet i deres egen omgangskreds: nemlig helliggørelsen af det almindelige arbejde og af de familiære og sociale pligter.
Selv religiøse kommuniteter kan udnævnes til Opus Dei medarbejdere. Disse kommuniteter – for øjeblikket omkring 500 – hjælper prælaturet`s virksomhed gennem deres daglig bøn.